安捷倫二維液(ye)相(xiang)色譜助力(li)維生素 D 測定第四(si)法(fa)
安捷倫二維液(ye)相(xiang)色譜精準(zhun)助力(li)應(ying)對(dui) 2020 版(ban)藥(yao)典(dian) 0722 維生素 D 測定第四(si)法(fa)
維(wei)生素 D 是人(ren)體(ti)所必須的脂(zhi)溶(rong)性維生(sheng)素。維生素D的基(ji)本(ben)作用(yong)是(shi)能促(cu)進(jin)鈣和(he)磷(lin)的吸收，缺(que)乏維(wei)生(sheng)素 D，會影(ying)響(xiang)鈣的吸收和骨(gu)代謝，最終引起(qi)佝僂病(bing)、軟(ruan)骨癥或骨(gu)質疏(shu)松(song)癥等。作為(wei)藥物(wu)的維生素 D 相(xiang)關制(zhi)劑(ji)是補(bu)充維生素 D 缺(que)乏的最直接(jie)的途(tu)徑。準(zhun)確測(ce)定(ding)維(wei)生(sheng)素 D 及其(qi)前體(ti)的含(han)量(liang)，能(neng)夠(gou)保證維(wei)生素 D 達(da)到目標(biao)的效價，從(cong)而保證藥(yao)物(wu)的有效性和安全(quan)性。
安捷倫二維液(ye)相(xiang)色譜精準(zhun)助力(li)應(ying)對(dui)
2020 版(ban)藥(yao)典(dian) 0722
維生素 D 測定第四(si)法(fa)
2020 版(ban)藥(yao)典(dian) 0722 新(xin)增(zeng)維(wei)生素 D 測定第四(si)法(fa)相(xiang)關背景(jing)
維(wei)生素 D 測定的難點在於(yu)含(han)維(wei)生(sheng)素 A 醇(chun)及其(qi)他相(xiang)應脂(zhi)溶(rong)性雜(za)質的供試品(pin)，如維生素 AD 軟(ruan)膠(jiao)囊、滴劑(ji)等，其(qi)基(ji)質中(zhong)存(cun)在大(da)量(liang)油性輔料（大(da)豆(dou)油）和維(wei)生素 A 醇(chun)的幹擾(rao)，同(tong)時(shi)維(wei)生(sheng)素 D2/D3 含(han)量(liang)低(di)（部(bu)分(fen)品(pin)種維生(sheng)素 D2/D3 含(han)量(liang)僅占(zhan) 1‰ 左右) ，加上維生(sheng)素 D 易受(shou)光熱影(ying)響(xiang)產(chan)生(sheng)前(qian)維(wei)生素 D（pre-vitamin D）、反式(shi)維(wei)生素 D (Trans vitamin D)、速甾醇(chun)（tachysterol）和光甾(zai)醇(chun)（lumisterol）等。對於(yu)本(ben)類樣(yang)品(pin)，2015 版(ban)藥(yao)典(dian)和 2020 版(ban)藥(yao)典(dian)的第二法和(he)第(di)三(san)法(fa)，通(tong)常需要(yao)將樣品(pin)進行(xing)皂(zao)化、有(you)機(ji)溶劑(ji)液(ye)液(ye)萃(cui)取，結合反相(xiang)色譜系(xi)統凈(jing)化(hua)，最(zui)後再采(cai)用(yong)正(zheng)相(xiang)色譜系(xi)統進(jin)行(xing)定(ding)量(liang)檢(jian)測。方(fang)法測(ce)定結果的準(zhun)確性和重現(xian)性較(jiao)難控(kong)制(zhi)，也(ye)嚴重影(ying)響(xiang)方(fang)法(fa)的分(fen)析效率。
通(tong)過(guo)二維柱(zhu)切換的液(ye)相(xiang)色譜技術不(bu)僅可以(yi)提(ti)升(sheng)系(xi)統分(fen)離能(neng)力(li)，改善(shan)結構(gou)相(xiang)似化合物(wu)的分(fen)離分(fen)析；同(tong)時(shi)可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)第壹維的初(chu)步分(fen)離去(qu)除(chu)樣(yang)品(pin)基(ji)質中(zhong)大(da)量(liang)雜(za)質成(cheng)分(fen)幹擾(rao)，實現樣品(pin)凈化。因(yin)此(ci) 2020 版(ban)藥(yao)典(dian) 0722 維生素 D 測定新(xin)增(zeng)了(le)第四法即(ji)在(zai)線二(er)維(wei)液(ye)相(xiang)色譜法，方(fang)法第壹(yi)維(wei)和(he)第(di)二維(wei)均(jun)采(cai)用(yong)正(zheng)相(xiang)色譜體(ti)系(xi)，其(qi)主要優(you)點是樣品(pin)可用(yong)正(zheng)己烷(wan)溶(rong)解後直接(jie)進樣(yang)分(fen)析，且(qie)具(ju)有(you)載(zai)樣量(liang)大(da)，易去(qu)除(chu)非(fei)極性基(ji)質幹(gan)擾(rao)成(cheng)分(fen)，同時(shi)維(wei)生(sheng)素 D 與其(qi)他羥(qiang)基(ji)化的代謝物(wu)分(fen)離良(liang)好(hao)等優點。
安捷倫的應對方案(an)
儀(yi)器(qi)系(xi)統的基(ji)本(ben)搭配如圖(tu) 1 所示(shi)，整(zheng)體(ti)上需(xu)要(yao)兩(liang)套泵(beng)、壹個兩(liang)位六通(tong)切換閥、單或雙(shuang)紫(zi)外(wai)檢(jian)測器(qi)組成(cheng)。
主要色譜條(tiao)件(jian)
色譜柱(zhu)：
第壹維(wei)：ChromCore VD-ChP4, 2.1*150mm，3μm（納譜分(fen)析，貨(huo)號S015-030012-02115S）；
第(di)二維(wei)：Zorbax Silica, 3.0*100mm, 1.8μm（Agilent Technologies，貨(huo)號 828975-301）；
流(liu)動(dong)相(xiang)：第壹維(wei)：A: 正(zheng)己烷(wan)；B: 異丙(bing)醇(chun); C: 正(zheng)己烷(wan)：正(zheng)戊(wu)醇(chun)：異丙(bing)醇(chun) (98：1：1); 按下表進(jin)行(xing)梯(ti)度洗(xi)脫：
表 1. 第(di)壹(yi)維(wei)流動(dong)相(xiang)梯度
第二(er)維：正(zheng)己烷(wan)：正(zheng)戊(wu)醇(chun)：異丙(bing)醇(chun)=996：2：2；等度洗(xi)脫。
流速(su)：0.5 mL/min;
柱(zhu)溫：40℃；
波長(chang)：265 nm；
閥切時(shi)間(jian)窗(chuang)口(kou)：前(qian)維(wei)生(sheng)素 D， 保留時(shi)間(jian)前(qian)後(hou)各(ge) 1.5min；維(wei)生素 D，出峰開始(shi)前和結束後(hou)各(ge) 1.5 min；Loop 環(huan)體(ti)積為(wei) 9 mL。
對(dui)照品(pin)和樣品(pin)溶液(ye)按照《中國(guo)藥典(dian)》2020 年(nian)版(ban)四(si)部(bu)通(tong)則(ze) 0722 維(wei)生(sheng)素 D 測定法第(di)四(si)法(fa)要求進行(xing)制(zhi)備。
主要結果
1、對(dui)照品(pin)分(fen)析譜圖(tu)
按(an)照藥典(dian)采(cai)用(yong)脲(niao)基(ji)修飾(shi)的 HILIC 色譜柱(zhu)和正(zheng)相(xiang)體(ti)系(xi)作為(wei)第(di)壹(yi)維分(fen)離，結果前(qian)維(wei)生素 D 和維生素 D 的分(fen)離度為 9.8，維(wei)生素 D 的理(li)論(lun)板數(shu)為(wei) 7600，*系(xi)統適(shi)應(ying)性測試要求；目標物(wu)在第二維(wei)分(fen)離的峰對稱(cheng)性良好(hao)。
2、實際(ji)樣品(pin)與對照品(pin)疊加譜圖(tu)
由第壹維(wei)的樣品(pin)分(fen)離譜圖(tu)可(ke)以(yi)看(kan)出，雖然維生素 D 分(fen)離良(liang)好(hao)，但前(qian)維(wei)生素 D 由於(yu)含(han)量(liang)較(jiao)低(di)，易受(shou)到前面大(da)量(liang)基(ji)質的幹擾(rao)，通(tong)過(guo)柱(zhu)切換方式(shi)將該目標(biao)組(zu)分(fen)切至第二(er)維進(jin)行(xing)分(fen)離，能(neng)夠(gou)對前(qian)維生素 D 實現無幹(gan)擾(rao)分(fen)離分(fen)析。
小(xiao)結
通(tong)過(guo)二維柱(zhu)切換法，能夠(gou)有效去除(chu)樣(yang)品(pin)基(ji)質幹(gan)擾(rao)，改善(shan)前維(wei)生(sheng)素 D 的分(fen)離，實現對前維(wei)生(sheng)素 D 和維生素 D 的定量分(fen)析；
本(ben)法對(dui)原(yuan)有(you)標準(zhun)方法(fa)中(zhong) 35~60min 的清洗(xi)過(guo)程進行(xing)適(shi)當(dang)調整(zheng)，嵌入了強洗(xi)過(guo)程，既利(li)於(yu)強(qiang)保留化合物(wu)的快速洗(xi)脫（圖(tu) 3 中(zhong) 36-46min 色譜峰），縮(suo)減整(zheng)體(ti)分(fen)析時(shi)間(jian)（由 80min 縮(suo)減到 65min），加快分(fen)析效率，也(ye)可避免潛在的強保留物(wu)質對(dui)後(hou)續分(fen)析造(zao)成(cheng)影(ying)響(xiang)，使(shi)第(di)壹(yi)維(wei)分(fen)離更穩(wen)定；
由於(yu)流(liu)動(dong)相(xiang)配制(zhi)和色譜柱(zhu)批次間(jian)的差異，需(xu)要適(shi)當(dang)調整(zheng)維生素 D 在第壹維(wei)色譜柱(zhu)上的出峰時(shi)間(jian)在(zai) 25min 左右，同時(shi)通(tong)過(guo)對流動(dong)相(xiang)比(bi)例的微調，可(ke)以(yi)使(shi)樣(yang)品(pin)中含(han)量(liang)較(jiao)低(di)且(qie)易受(shou)基(ji)質幹(gan)擾(rao)的前維生素 D 在第二維(wei)中(zhong)分(fen)離更好。
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